Les champignons eboueurs

La quasi-totalité des cours d'eau en France est polluée. Des mélanges de résidus d'hydrocarbures, de métaux lourds et de pesticides naviguent au gré des cours d'eau, s'infiltrent dans les sols et se fixent sur de très longues périodes aux couches sédimentaires, notamment à l'argile. Outre les dégâts environnementaux, ces polluants peuvent rendre l'eau impropre à la consommation. Aujourd'hui, les centres d'épuration utilisent des systèmes de nanofiltration pour dépolluer l'eau. Il s'agit de membranes percées de pores de très petits diamètres qui retiennent de manière purement mécanique les impuretés. Cette technique de nanofiltration a principalement deux défauts. D'une part, étant donnée la finesse des pores, ils s'obstruent rapidement et la membrane doit être souvent changée ; d'autre part, cette méthode exige de telles filtrations que l'eau purifiée est très fortement déminéralisée.

En conséquence, ce protocole est très coûteux et la qualité de l'eau n'est pas totalement satisfaisante à l'issue du traitement. Pour pallier ces problèmes, une équipe de chercheurs de l'INRA, dirigée par Christian Mougin de l'unité de phytopharmacie et médiateurs chimiques de VersaillesGrignon, en collaboration avec l'École de Chimie de Paris, a mis au point un système d'épuration biologique, qui pourrait diminuer les inconvénients de la nanofiltration. Le principe est de faire pénétrer dans un bioréacteur une eau contaminée. Le dispositif contient une membrane sur laquelle sont fixées des enzymes, les laccases. Alors que les enzymes ont habituellement des cibles très spécifiques, ces protéines ont naturellement une grande affinité pour un grand nombre de polluants et peuvent les polymériser. Ainsi, les composés polymérisés, donc de plus grandes tailles et insolubles dans l'eau, peuvent être retenus directement par une membrane dont les pores de grandes tailles laissent passer l'eau sans la déminéraliser. Certains voient en cette alternative une solution peu coûteuse et très efficace aux problèmes de l'épuration physico-chimique classique. Encore au stade expérimental, ce type de procédé doit encore être développé. Pour ce faire, une meilleure connaissance de la structure et des propriétés de l'enzyme est nécessaire. En se fondant sur ces données, les chercheurs pourraient alors modifier la structure de la protéine pour orienter son activité vers une gamme de pesticides et de résidus chimiques large.

Une enzyme ambiguë

Les laccases sont la clef du système. Cette famille d'enzymes est habituellement sécrétée par des plantes et notamment des champignons filamenteux. Dans le cas du bioréacteur susmentionné, les protéines ont été isolées chez Trametes versicolore. Ces champignons parasitent habituellement les troncs d'arbres morts ou vivants et forment des lamelles superposées très robustes.

Les laccases sont depuis longtemps perçues comme ayant des propriétés intéressantes pour l'environnement car les membres de cette famille sont capables de catalyser les mécanismes de polymérisation des phénols et des amines, résidus souvent présents dans les rejets de déchets industriels. Par ailleurs, elles sont également capables de dépolymériser la lignine des troncs d'arbres pour permettre aux champignons de s'y insérer.

Ainsi, cette enzyme a une activité ambiguë puisqu'elle peut avoir un effet et son contraire. La caractérisation de son activité est aujourd'hui au centre de bien des programmes de recherches. Selon Christian Mougin, cette activité dépend principalement des conditions environnementales, et notamment la température ou le pH.

Les laccases sont des enzymes à cuivre qui utilisent l'oxygène moléculaire pour fonctionner, ce qui les rend très simples à alimenter en cas d'utilisation « artificielle ». Ces protéines doivent être glycosylées pour être actives et ont un poids moléculaire de 60 à 80 kDa. Leur site actif est composé de quatre atomes de cuivre. Cinq isomères ont été identifiés pour cette enzyme, ils dépendent de l'état de glycosylation de la protéine. Si l'affinité de la structure pour les polyphénols est connue et bien identifiée, l'équipe de l'INRA a démontré que des interactions sont possibles avec plusieurs types de substrats notamment nombres de polluants et des résidus de pesticides. Pour ce faire, les chercheurs ont cristallisé la protéine. Le but de cette démarche était d'identifier parfaitement le type de site actif de l'enzyme. Ainsi, l'équipe a pu spéculer sur la gamme des ligands polymérisables ou dégradables que ce soit de manière naturelle ou au terme d'une modification du gène source chez l'individu producteur.

Cette enzyme est aussi reconnue comme étant très résistante. Ainsi, elle est très facilement isolable car les scientifiques peuvent la purifier sans la dégrader. Par ailleurs, son activité peut être maintenue constante pendant plusieurs semaines, à température ambiante, à même la paillasse, précise Christian Mougin. En contrepartie, cette extrême robustesse génère une difficulté importante pour briser l'assemblage des acides aminées et étudier la structure des laccases. Cet élément accroît encore l'intérêt environnemental et économique de l'enzyme. En effet si elle peut rester efficiente sur de très longues périodes, les coûts de maintenance des systèmes d'épuration devraient être grandement diminués.

Les mutants à la rescousse

Cependant, quelques obstacles empêchent encore d'envisager une application industrielle à court terme. Tout d'abord, l'enzyme semble fonctionner à son optimum dans des conditions de pH acide, avoisinant 5. Or les cours d'eau sont généralement plutôt dans des gammes de pH neutres, entre 7 et 8. Par ailleurs, certains polluants passent outre la « barrière » des laccases, notamment l'atrazine, un herbicide récemment interdit en France, qui représente un problème écologique majeur. Les pesticides comme l'atrazine sont des composés hétérocyclés, donc des structures très différentes des polyphénols et des amines, et 1'enzyme ne semble pas avoir d'effet sur ces constructions.

Les chercheurs ont donc pour but d'optimiser l'efficacité des laccases par des mutagenèses aléatoires, c'est-à-dire en fabriquant le plus grand nombre d'enzymes modifiés possible et en isolant, à l'intérieur de ce pool, ceux qui présentent des propriétés intéressantes. Les premiers mutants ont déjà été obtenus et leurs examens viennent tout juste de commencer.

Tout d'abord, l'équipe du docteur Mougin désirerait identifier des mutants capables de fonctionner dans des conditions de pH plus élevé, afin que leurs utilisations soient possibles dans des sols et dans l'eau, et non pas seulement dans l'eau purifiée et adaptée du laboratoire, ironise le chercheur. Ensuite, la modification de la chaîne d'acides aminés de la protéine pourrait permettre un changement de conformation du site actif. La chance aidant, celui-ci pourrait alors devenir affin envers d'autres substrats, et pourquoi pas l'atrazine. Enfin, les scientifiques espèrent pouvoir augmenter le pouvoir d'oxydoréduction du site actif de l'enzyme. Ceci permettrait d'accroître considérablement la vitesse et l'action catalytique des laccases, et donc leur efficacité dans des procédés de dépollution environnementaux.

Les mutants ne sont pas obtenus directement à partir des champignons, Trametes cersicolor, au sein desquels l'enzyme natif a été isolé. En effet, la modification génétique d'un tel organisme supérieure pour une cible si précise est pour l'instant trop complexe. Plusieurs choix s'offraient alors aux chercheurs pour produire leurs mutants. Escherischia coli n'a, pour une fois, pas pu être utilisée, car cet organisme produit des laccases non glycosylées, donc inactives. L'équipe a donc du se tourner vers une levure, Yarrowia lipolitica, qui est capable de produire l'enzyme active. Le rendement de cette source, si les conditions de culture sont bien maîtrisées et adaptées, est tout à fait satisfaisant et peut être comparable à celui du champignon même.

Traiter les sols

Si l'exemple du bioréacteur de traitement des eaux contaminées est extrêmement attirant et élégant, en fait, l'équipe de l'INRA s'intéresse plus généralement aux dépollutions des sols.

L'idée des chercheurs serait de pouvoir utiliser des laccases immobilisées directement dans les sols. Le principe aurait alors pour but d'exploiter le pouvoir détoxiquant des laccases sur les polluants qui se fixent à long terme sur les couches géologiques sédimentaires. Cependant, la tolérance des enzymes dans de telles conditions est mal connue et malgré sa robustesse, il n'est pas évident qu'elles garderaient toutes leurs potentialités à long terme. A priori leur durée de vie serait alors fonction de la qualité du substrat auquel elles seraient confrontées.

Le problème qui se pose à ce stade est de savoir comment introduire les laccases dans le sol. Plusieurs options sont possibles. Premièrement, l'introduction via des champignons.

Cette méthode se heurte au problème évoqué précédemment qui serait de modifier génétiquement les champignons pour qu'ils produisent le mutant adapté. Deuxièmement, la dissémination de levure Yarrowia lipolitica. Cette technique semble réalisable et a la faveur de Christian Mougin. Troisièmement, la dissémination directe des laccases dan le sol. Ce procédé est actuellement en cours d'étude par des équipes américaines et sa faisabilité reste à démontrer.

Toutefois, un dernier verrou complexifie encore le choix que doivent faire les chercheurs. Cette fois, ce n'est pas un problème technique mais un questionnement éthique. Les chercheurs ignorent complètement l'impact qu'aurait l'implantation dans le sol de champignons ou de levures génétiquement modifiées, et l'effet psychologique qu'il provoquerait sur la population. Ces méthodes sont pourtant déjà appliquées dans certains pays anglo-saxons. Pour savoir si la France va suivre la même vole, l'équipe de l'INRA a confiance dans l'axe névralgique de son travail fondamental qui est la compréhension et l'optimisation de la structure et du fonctionnement des laccases. Elle cherche également à déterminer l'ensemble des éléments environnementaux susceptibles d'inhiber le environnementaux susceptibles d'inhiber le fonctionnement de l'enzyme. Les données recueillies permettront certainement d'avoir une idée précise des conséquences qu'implique une telle démarche et de s'engager alors dans une voie.

Viabilité économique

Les chercheurs se donnent deux à trois ans pour aboutir ou renoncer à leur projet. En effet, le financement pourrait poser problème à court terme. L'idéal pour l'équipe serait de trouver un partenaire industriel qui pourrait, par exemple, financer une thèse. Cependant, pour attirer un tel allié, il faudrait avoir une idée précise des économies que peuvent engendrer ces techniques. L'acteur le mieux adapté à ce type de démarche reste une entreprise spécialisée dans la dépollution. Comme l'explique Christian Mougin, nous avons montré la faisabilité du système, maintenant ce n'est pas à nous d'en établir la viabilité économique, seul un partenaire industriel en serait capable.

Au milieu de ces contraintes, interrogations, spéculations sur l'avenir, que devient le fameux bioréacteur équipé d'une membrane à macropores où sont fixées les laccases ? Il pourrait très bien continuer son chemin seul. En effet, l'équipe n'a pas déposé de brevet pour cette innovation. Donc n'importe quel industriel peut en reprendre le principe et le développer pour son compte. Pourtant cela ne semble pas raisonnable car les laccases n'ont sans doute pas encore montré tout ce dont elles sont capables. Les études de mutants devraient à plus ou moins long terme approfondir les réflexions menées sur la création de systèmes antipollutions. L'équipe de l'INRA est très optimiste à l'aube de cette étude. Les bioréacteurs seront sans doute dans les quelques années à venir le théâtre idéal de la transformation des centres d'épuration et de la mise en place des systèmes de traitements des eaux d'exploitations agricoles. Les laccases pourraient en être les héroïnes et si leur mise en lumière ne se fait au sein de l'Hexagone, elles trouveront la voie vers le succès ailleurs à coup sûr.

Source: Ludovic Dupin; Cibac mag